隨著人類基因組草圖完成，蛋白質組研究全面展開。作為經典蛋白質組學分離技術，雙向電泳越來越被科研人員所熟知。但要想得到漂亮的雙向電泳譜圖，卻并不那么容易。我們將針對雙向電泳過程中常出現的問題進行總結，希望能給您的實驗帶來幫助。

 

本期我們重點關注雙向電泳圖譜中常出現的水平條紋。雙向電泳水平條紋的產生主要來自于樣品本身和一向等電聚焦電泳，下面就從這兩方面的原因及其解決辦法進行詳述。

 

一、樣品制備問題

 

1．樣品中存在影響等電聚焦的雜質

蛋白樣品中任何離子凈電荷的污染都將影響等電聚焦，并引起水平條紋。嚴重的污染物干擾，我們在等電聚焦過程中可以觀察到：低電壓運行時，軟件和儀器監測到的電流很快就達到50 µA的限定，預設的高電壓不能達到；嚴重時可能導致電弧產生或IPG膠條燃燒。常見的污染包括樣品制備過程中引入的鹽和其他帶電小分子、去污劑；以及樣品本身內源性的雜質，包括各種內源性的帶電小分子，核酸、多糖、脂類、酚類等非蛋白雜質。了解樣品中主要污染物的組成，并且在樣品制備過程中采取有針對性的辦法去除污染物即可改善水平條紋。

 

鹽和帶電小分子：水化上樣將鹽離子濃度降低到10 mM以下，而杯上樣則限制樣品鹽濃度不超過50 mM。脫鹽常用脫鹽柱、旋轉透析或透析袋；而用TCA和丙酮沉淀再重懸，是一個更有效的脫鹽方法，但往往TCA清除不盡，蛋白復溶效率不高。2-D Clean-Up Kit （貨號80-6484-51）則采用**的共沉淀劑和洗滌附加物，可以定量沉淀各種來源的蛋白質，蛋白復溶率通常大于90%。使用2-D Clean-Up Kit不會造成斑點增加或減少，或斑點位置的變化，操作簡單，整個過程可以在一個小時內完成。另外，使用劣質水、尿素或其他試劑也會造成導電性升高；尿素還易分解為帶電的產物。選用優質試劑，重要的試劑包括尿素、硫脲、DTT、去污劑、載體兩性電解質、水等，防止一向等電聚焦所需的這些試劑因本身純度不夠，而引入帶電雜質。即使選擇了優質尿素、硫脲，保存得當也非常關鍵。尿素、硫脲吸水后會發生離子化，影響等電聚焦。樣品中鹽離子濃度還可以通過改變IEF的程序來降低。先設一步或幾步低壓程序，如100V 3h，100v---1000v gradient 3h，然后再升高電壓完成IEF，這個低壓程序可以使樣品中的離子首先遷移到IPG膠條的末端，降低電內滲，減少水平條紋的形成。

 

帶電荷的去污劑：**常用的離子型去污劑如SDS，能夠包被蛋白，并徹底改變它們的凈電荷，**終影響它們的等電點，導致條紋出現以及IPG膠條中樣品的損失。如果在樣品中存在SDS，那么其用溶脹液稀釋后的**終濃度不能超過0.25%?；蛘撸砑悠渌请x子型去污劑或兼性離子去污劑稀釋 SDS的濃度。

 

核酸：樣品的核酸污染也會導致水平條紋的出現。高分子量的核酸還會堵塞膠孔，阻礙聚焦。許多蛋白與核酸結合，產生了蛋白-核酸的混合物，每個都有著不同的等電點。在等電聚焦之前用核酸酶（貨號80-6501-42）處理樣品，可去除樣品中的核酸?；蛘咴跇悠分苽鋾r超聲剪切核酸，也可在精胺存在時通過超速離心也可去除核酸。

 

多糖：唾液酸、帶負電荷的多糖也能產生與核酸類似的水平條紋。不帶電荷的多糖通過阻塞凝膠孔，阻礙樣品進入IPG膠條，導致條紋出現。去除多糖用TCA/acetone (Damerval et al. 1986)，或者醋酸銨(甲醇飽和硫酸銨)沉淀然后用苯酚抽提(Hurkman and Tanaka 1986)。

 

2． 蛋白被修飾——氨基甲?；?/div>