分子生物學試驗方法探討二－瓊脂糖凝膠電泳技術

分子生物學試驗方法探討二－瓊脂糖凝膠電泳技術、瓊脂糖凝膠的特點
    天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約占80%）及瓊脂膠（agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產生較強的電滲現象，加之硫酸根可與某些蛋白質作用而影響電泳速度及分離效果。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳，其優點如下。
（1）瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進行電泳。
（2）瓊脂糖凝膠結構均勻，含水量大（約占98%~99%），近似自由電泳，樣品擴散較自由電流，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好。
（3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。
（4）電泳后區帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。
    目前，常用瓊脂糖作為電泳支持物，分離蛋白質和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學相結合，發展成免疫電泳技術，能鑒別其他方法不能鑒別的復雜體系，由于建立了超微量技術，0.1ug蛋白質就可檢出。
    瓊脂糖凝膠電泳也常用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內切核酸酶圖譜制作等。由于這種方法操作方便，設備簡單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實驗方法之一。

二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳
    瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據它們的相對分子量質量及分子構型，同時與凝膠的濃度也有密切關系。
1、核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關系
（1）DNA分子的大小 在凝膠中，DNA片段遷移距離（遷移率）與堿基對的對數成反比，因此通過已知大小的標準物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。但是當DNA分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜超過此值。
（2）瓊脂脂糖的濃度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。

        表 瓊脂糖濃度與DNA分離范圍
瓊脂糖濃度 /%    0.3    0.6    0.7    0.9    1.2    1.5    2.0
線狀DNA大小/kb  60-5  20-1  10-0.8  7-0.5  6-0.4  4-0.2  3-0.1

2、核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關系
    不同構型DNA的移動速度次序為：供價閉環DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直線DNA>開環的雙鏈環狀DNA。當瓊脂糖濃度太高時，環狀DNA（一般為球形）不能進入膠中，相對遷移率為0（Rm=0），而同等大小的直線雙鏈DNA（剛性棒狀）則可以長軸方向前進（Rm>0），由此可見，這三種構型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時，也受到電流強度、緩沖液離子強度等的影響。
3、電泳方法
（1）凝膠類型 
    用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型（平板型）。水平型電泳時，凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1-2mm，故又稱為潛水式。目前更多用的是后者，因為它制膠和加樣比較方便，電泳槽簡單，易于制作，又可以根據需要制備不同規格的凝膠板，節約凝膠，因而較受歡迎。
（2）緩沖液系統 
    缺少離子時，電流太小，DNA遷移慢；相反，高離子強度的緩沖液由于電流太大會大量產熱，嚴重時，會造成膠熔化和DNA的變性。
常用的電泳緩沖液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TEA），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液，臨用時稀釋到所需倍數。
TAE緩沖能力較低，后兩者有足夠高的緩沖能力，因此更常用。TBE濃溶液長期貯存會出現沉淀，為避免此缺點，室溫下貯存5×溶液，用時稀釋10倍0.5×工作溶液即能提供足夠緩沖能力。
（3）凝膠的制備 
    以稀釋的電極緩沖液為溶劑，用沸水浴或微波爐配制一定濃度的溶膠，灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷卻。
（4）樣品配制與加樣 
    DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內含有0.25%溴酚藍或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結果產生U形條帶，可改用2.5%Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。
（5）電泳 
    瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結果表明，在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場強度增加時，較大的DNA片段遷移率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高，電泳分辨率反而下降，為了獲得電泳分離DNA片段的**大分辨率，電場強度不宜高于5V/cm。
    電泳系統的溫度對于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進行電泳，只有當凝膠濃度低于0.5%時，為增加凝膠硬度，可在4℃進行電泳。
（6）染色和拍照 
    常用熒光染料溴乙錠（EB）染色，在紫外光下觀察DNA條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統輸出照片，并進行有關的數據分析。

三、印跡轉移電泳
    生物化學與分子生物學的研究工作經常需要對電泳分離后的DNA進行分子雜交，但瓊脂糖不適合于進行雜交操作，1975年，Southren創造了將DNA區帶原位轉移到硝酸基纖維素膜（NC膜）上，再進行雜交的方法，被稱為Southren印跡法。隨后，Alwine等將類似方法用于RNA印跡，被戲稱為Northern印跡，1979年Towbin等設計了將蛋白質從凝膠轉移到硝酸纖維素膜的裝置，將蛋白質轉移到膜上，再與相應的抗體等配體反應，被戲稱為Western印跡，這種裝置將膜和凝膠、濾紙等制成夾心餅干狀，用低電壓高電流電泳完成轉移。1982年Reinhart等用電轉移法將等電聚焦后的蛋白質區帶從凝膠轉移到特定膜上，稱Eastern印跡。
目前國內外有多種核酸、蛋白質印跡轉移的電泳裝置出售，使印跡轉移速度快效率高、重復性好，應用更加廣泛。聚丙烯酰胺凝膠也可用于印跡轉移電泳，但轉移蛋白質時，凝膠中不可含有SDS、尿素等變性劑。用于轉移電泳的支持膜亦有多種選擇，近些年用尼龍膜較多，因為尼龍膜機械性能好，烘烤不變脆，使用時比硝酸纖維素膜更方便。
    進行印跡轉移電泳時，要注意緩沖液的離子強度要低，pH要遠離pI，使蛋白質帶有較多電荷，一般用穩定性較好的Tris-緩沖體系。還要注意凝膠與支持膜之間有能有氣泡。適當提高電壓或電流可以提高轉移速度，但亦會增加熱效應，故電壓或電流不可過高。

四、交變脈沖電場凝膠電泳
    一般瓊脂糖凝膠電泳只能分離小于20kb的DNA。這是因為在瓊脂糖凝膠中，DNA分子的有效直徑超過凝膠孔徑時，在電場作用下，迫使DNA變形擠過篩孔，而沿著泳動方向伸直，因而分子大小對遷移率影響不大。如此時改變電場方向，則DNA分子必須改變其構象，沿新的泳動方面伸直，而轉向時間與DNA分子大小關系極為密切。1983年Schwartz等人根據DNA分子彈性弛豫時間（外推為0的滯留時間）與DNA分子大小有關的特性，設計了脈沖電場梯度凝膠，交替采用兩個垂直方向的不均勻電場，使DNA分子在凝膠中不斷改變方向，從而使DNA按分子大小分開。后來Carle等改進了電泳技術，并發現周期性的反轉換電場(periodic inversion of the electric field)亦能使大分子DNA通過電泳分開。電泳系統是由一水平式電泳槽和兩組獨立、彼此垂直的電極組成，一組電極負極為N，正極為S；另一組負極為W，正極為E。一塊正方形瓊脂糖凝膠板（10cm*10cm或20cm*20cm）呈45度放中央。電場在N-S和W-E之間交替建立。電場交替改變的時間長短與欲分離的DNA分子大小有關。電泳時，DNA分子處在連續間隔交替的電場中。首先向S極移動，然后改向E極。在每次電場方向改變時，DNA分子就要有一定的時間松弛，改變形狀和遷移方向。只有當DNA分子達到一定構型后，才能繼續前時。DNA分子凈移動方向與加樣線垂直，使樣品中各組分沿同一泳道形成各自的區帶。交變脈沖電泳可有效分離數百萬堿基對的大分子DNA。較新式的儀器電極間的角度和脈沖時間均可調，使用更加方便。
    此外，瓊脂糖平板常用于免疫擴散技術的電泳技術相結合的多種免疫電泳。