Western blot 實(shí)驗(yàn)技巧精要

——輕松獲得高質(zhì)量 western blot 條帶圖

 

Western blot 方法在 SCI 文章中出現(xiàn)的頻率非常高，漂亮的 WB 電泳圖可以給文章增色不少。但是 WB 實(shí)驗(yàn)的步驟瑣碎，細(xì)節(jié)頗多，要想得到令人滿意的結(jié)果還是需要花費(fèi)很多時(shí)間和精力去摸索實(shí)驗(yàn)技巧的。

 

小編經(jīng)過了一段時(shí)間的努力，已經(jīng)可以比較輕松的實(shí)現(xiàn)用 WB 方法對(duì)磷酸化蛋白計(jì)算藥物的 IC50 值（見下圖）。

    
 

接下來，小編將結(jié)合自己的經(jīng)驗(yàn)以及網(wǎng)上可以搜索到的 WB 實(shí)驗(yàn)技巧，為大家介紹一下 WB 實(shí)驗(yàn)過程中的關(guān)鍵點(diǎn)。雖然 WB 實(shí)驗(yàn)步驟很多，但只要抓中其中的幾個(gè)重點(diǎn)方面，就可以得到干凈、漂亮、清晰、客觀的電泳圖。

 

一、 樣品準(zhǔn)備部分

小編認(rèn)為，我們不應(yīng)該太過重視 WB 電泳部分的操作技巧，樣品準(zhǔn)備才是整個(gè) WB 實(shí)驗(yàn)中**重要的一個(gè)環(huán)節(jié)（沒有之一）。否則 WB 電泳技術(shù)再高也無法得到好的結(jié)果。小編認(rèn)為以下 3 點(diǎn)值得大家重點(diǎn)關(guān)注：

 

1. 注意孵育、終止時(shí)間

如果想得到漂亮的梯度條帶，無論是不同處理時(shí)間的樣品，還是不同給藥濃度的樣品，在處理過程中都一定要嚴(yán)格按照設(shè)計(jì)的時(shí)間來孵育和終止，尤其是對(duì)于磷酸化蛋白，哪怕 1 秒也不要提前或耽擱。

 

2. 抑制蛋白降解

這是樣品制備中**需要注意的部分。抑制樣品蛋白降解的方法主要有兩種：

 

(1) 使用蛋白酶抑制劑

小編使用的是羅氏公司（Roche）的蛋白酶抑制劑 Cocktail 片劑，效果不錯(cuò)。再與 PMSF 共同使用，可以很好地抑制蛋白降解。

 

(2) 全程低溫操作

提前預(yù)冷 PBS、裂解液甚**槍頭等，從收集細(xì)胞開始一直到煮樣的全過程都應(yīng)該盡可能的保持在冰上操作。小編除了使用冰盒，大多數(shù)操作都是在 4℃冷房中進(jìn)行的，雖然有點(diǎn)麻煩和辛苦，但是效果非常好。

 

3. 裂解液用量

將收集好的細(xì)胞加入裂解液進(jìn)行裂解在操作上是非常簡(jiǎn)單的，所以這一步的重要性很容易被大家忽視。裂解液的用量直接決定了細(xì)胞裂解程度以及裂解后的蛋白濃度。

 

如果加入的裂解液不足，蛋白濃度太高，會(huì)造成與上樣緩沖液反應(yīng)不充分，電泳后會(huì)出現(xiàn)多條條帶，條帶形狀也不好。小編做磷酸化蛋白檢測(cè)時(shí)為了在每個(gè)膠孔中盡可能多上樣，所以用體積較少的裂解液制備了濃度很高的蛋白，結(jié)果就得不償失了（見下圖）。

 

這種情況的補(bǔ)救方法是給樣品繼續(xù)補(bǔ)加上樣緩沖液，煮樣，再跑膠。直接給已經(jīng)煮過樣的樣品補(bǔ)加上樣緩沖液再煮樣，跑膠后的效果也會(huì)好很多（見下圖）。

 

如果加入的裂解液過多，蛋白濃度太低，會(huì)導(dǎo)致在膠孔中的上樣量不足，條帶不清晰。

那么加入多少體積的裂解液**好呢？小編認(rèn)為，加入細(xì)胞團(tuán)體積的 10 倍體積的裂解液是一個(gè)比較好配比，當(dāng)然也可以根據(jù)目標(biāo)蛋白進(jìn)行調(diào)整。

 

二、 WB 電泳部分

得到了高質(zhì)量的樣品就已經(jīng)很接近成功了，小編接下來為大家介紹一些 WB電泳部分的注意事項(xiàng)。

 

1. 制膠

小編建議大家直接用制膠試劑盒，價(jià)格不貴，質(zhì)量不錯(cuò)。如果自己配置母液，就請(qǐng)注意 pH 值。

 

制膠部分**重要的是在配濃縮膠前不要著急將分離膠上面的水棄掉，先配好濃縮膠，在加 TEMED 之前再棄掉水。小編雖然沒有親自試過，但是如果棄掉水后 5 分鐘之內(nèi)還沒有加上濃縮膠，這塊膠**好還是不要用了。

 

2. 上樣

小編的經(jīng)驗(yàn)是上樣的總蛋白量一般是 20-70ug，這個(gè)要根據(jù)檢測(cè)蛋白的含量而定，需要摸索。

 

計(jì)算后每個(gè)樣品的上樣體積如果比較小，用槍頭直接上樣是完全可以的，如果上樣量超過 20ul，**好還是用微量注射器來上樣。上樣確實(shí)是需要多多練習(xí)和體會(huì)的，上樣技術(shù)高可以多上 10ul 樣品而不溢出。

 

如果需要上樣的體積太大，也可以先上一部分，然后跑幾分鐘電泳，再停下來繼續(xù)上樣，這是完全可以的，經(jīng)過下一步的調(diào)整，是不會(huì)影響效果的。

 

3. 電泳

每個(gè)孔的上樣量參差不齊沒關(guān)系，在樣品還沒有達(dá)到分離膠時(shí)用≤60V 的電壓可以很好的將樣品排列整齊，不容易跑出弧線或者不齊的線。

 

當(dāng)樣品達(dá)到分離膠后，通常會(huì)改成 100V 繼續(xù)電泳，小編認(rèn)為如果時(shí)間充足，電壓低一點(diǎn)效果不錯(cuò)。

 

請(qǐng)注意：電壓改一次就好，不要多次調(diào)整。

 

4. 轉(zhuǎn)膜

在轉(zhuǎn)膜環(huán)節(jié)小編認(rèn)為**重要的，也是**容易被大家忽視的一步是：預(yù)冷電轉(zhuǎn)液。大家一定感覺到過，電轉(zhuǎn)液加入甲醇后溫度會(huì)迅速上升，所以建議跑上電泳就配電轉(zhuǎn)液，加入甲醇后放入 4℃冰箱預(yù)冷。#p#分頁標(biāo)題#e#

 

當(dāng)然，也不要忘了趕氣泡，趕氣泡時(shí)方向不要太隨意，也不要太用力，否則可能會(huì)使膠變形，尤其是邊緣部分，然后你的條帶就會(huì)……比較有藝術(shù)感了……（見下圖）

 

**后別忘了膜需要先在甲醇中浸泡一下，然后在電轉(zhuǎn)液中洗一洗再使用。

 

5. 封閉、一抗、二抗

很多 WB 技巧介紹都會(huì)根據(jù)曝光后的電泳圖的效果指出需要降低或提高一抗的稀釋倍數(shù)，延長或減少二抗孵育時(shí)間等等。小編認(rèn)為只要按照說明書上推薦的比例做就沒有問題。出現(xiàn)各種條帶不好的情況，更大的可能是前面步驟中出現(xiàn)了問題，而不是這一步。

 

如果是用雜交袋進(jìn)行一抗和二抗的孵育，小編建議大家在放入膜后，將雜交袋中的 TBS-T 趕出來，然后再加入一抗或二抗，這樣一抗和二抗就不會(huì)被膜上殘留的 TBS-T 稀釋了。

 

6. 曝光

當(dāng)電泳圖上的條帶不夠好時(shí)，曝光相關(guān)參數(shù)也是經(jīng)常被認(rèn)為是需要調(diào)整的部分。小編依然認(rèn)為，曝光不是關(guān)鍵的步驟，前面做好了，曝光是很簡(jiǎn)單的。小編用的是 ECL 發(fā)光液曝光法。這種方法**需要注意的就是 ECL 要在條帶上分布均勻。小編用的是普通自封袋，將膜放在一片自封袋上，加上發(fā)光液后，再蓋上一片自封袋，用手指趕一下，發(fā)光液就會(huì)比較均勻，效果不錯(cuò)。

 

以上就是小編認(rèn)為 WB 實(shí)驗(yàn)中**需要注意的部分，相信做好以上內(nèi)容，做WB 實(shí)驗(yàn)會(huì)成為一項(xiàng)樂趣。小編想再次提醒一下大家，樣品制備部分是非常重要的，拼技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)主要在這一部分。相比之下，WB 電泳部分雖然也有一定的技巧，但更多的是拼態(tài)度。小編很喜歡 WB 實(shí)驗(yàn)，希望這些技巧能夠幫助您愛上western blot 實(shí)驗(yàn)！