暗室實驗
暗室實驗的操作流程：
1. 新鮮配制1-2ml工作液（A液與B液1:1或1:40混合配制）
2. 進入暗室，在黑暗的條件下，加入1μl未稀釋的二抗（HRP連接物）
3. 混合后，可立即在暗室中觀察到藍色光



暗室實驗的注意事項：
工作液按正確比例混合，且新鮮配制
在暗室中加入二抗
直接使用未稀釋的二抗
加入二抗后，立即觀察
注：暗室實驗可同時檢測底物是否有活性，以及二抗是否有活性。

如果暗室實驗結果陰性：
更換其它二抗，再次進行檢測；再次檢測結果仍為陰性，證明底物喪失活性。

暗室實驗結果陽性：
認為二抗及底物活性良好； Western Blot 系統需要進一步優化
優化抗原和抗體濃度的斑點雜交方法：斑 點 雜 交 方 法——優 化 抗 原 和 抗 體 濃 度

對于一個給定的抗原，**佳的抗體濃度依賴的抗原和抗體本身。抗原和抗體的親和力，以及一抗與二抗的特異反應都是不同的。**優抗原和抗體濃度可通過免疫印跡實驗中使用不同濃度的抗原和抗體作用確定。另外，更快和更簡單的方法是進行斑點印跡實驗。以下是使用超敏感信號底物進行的斑點印跡的操作方法。
注：所有的抗體稀釋度假定起始濃度為1 mg/mL。
1. 用TBS 和PBS 稀釋的蛋白樣品，好的稀釋方法是由樣品中的抗原稀釋濃度決定的，但是由于抗原的濃度是未
知的， 所以有必要進行寬范圍的稀釋度的檢測。SuperSignal West Pic 化學發光底物的檢測靈敏度可達皮g 水平，所以樣品的稀釋范圍可以從微克水平到皮克水平。如果要使用過多的抗原，結果會出現以下情況：非特異性條帶、模糊條帶和信號降低。
2. 準備轉印膜。所需膜的數量依賴于被屏蔽的一抗和/或二抗有多少種不同稀釋濃度。通常，一種或兩種一抗的稀
釋度是用兩種或三種不同的二抗稀釋度進行測定的。例如：1/1000 的一抗和1/50000 的二抗；1/1000 的一抗和1/100000 的二抗；1/5000 的一抗和1/50000 的二抗；以及1/5000 和1/100000 的二抗。
3. 將膜放在濾紙上。將抗原稀釋液點在膜上。用盡可能小量的稀釋液點在膜上（2-5 ul 為宜），因為用的體積越大，信號越彌散。抗原溶液在膜上干10-30 分鐘或直**無可見的水分。
4. 用含0.05%的Tween-20 封閉液封閉膜上的非特異性點，室溫震蕩孵育1 h。
5. 將一抗稀釋到封閉液/Tween-20 去污劑中，并加到膜上，室溫震蕩孵育1h。
6. 用TBS 或PBS 洗膜4-6 次，用盡可能大體積的洗脫液，在洗脫液中加入0.05%的吐溫，用以減少非特異背景。每次洗脫過程中，使膜懸浮在洗脫液中震蕩大約5 分鐘，倒出洗脫液并重復。孵育前，在洗脫液中短時間的漂洗可能會增加洗脫效率。
7. 制備二抗/HRP 結合的封閉試劑/Tween-20 去垢劑稀釋液，將二抗稀釋液加到膜上震蕩孵育1 h。
8. 按第6 步方法再次清洗膜。
9. 準備底物工作緩沖液，混合等體積的魯米諾/增強劑和穩定的過氧化物溶液。制備足夠體積確保印跡點完全濕潤，保證印跡點在孵育過程中不會干。推薦體積：0.1 ml/cm2印跡面。
10. 將膜在超感應顯色底物工作液中孵育5 分鐘；
11. 將膜從底物上移除，放到塑料布或其它防護膜上；
12. 將印跡貼到膠片上，在蛋白旁邊曝光。任何標準的或者增強的放射自顯影膠片都可以用。推薦**次曝光30-60 s，為得到**佳結果，曝光時間可不同。另外，也可用CCD 相機或其它成像設施；然而這些設施可能需要更長的曝光時間。
13. 在**佳的印跡膜上，超感應反應底物產生的信號可能會持續超過8 h。未獲得**佳結果，印跡能重復曝光到膠片上或者成像系統中。隨印跡時間的延長，需延長曝光時間。如果未得到**佳結果，可用抗原和/或抗體稀釋液重復進行這個程序。