聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質電泳提供載體，其凝固的好壞

直接關系到電泳成功與否，與促凝劑及環境密切相關； 

制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇tris－HCL系統，具體作用后面介紹； 

TEMED與AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固； 

十二烷基硫酸鈉（SDS）：陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質電荷、解離蛋白質之間的氫鍵、取消蛋白分子內的疏水作用、去多肽折疊。  tris中文品名: 三羥甲基氨基甲烷; 氨基丁三醇; 緩血酸胺 

你要知道Tris是個很會吃酸的東西，1M的Tris能吃下很多很多的HCl，換句話說，你如果用0.1M的鹽酸調500ml Tris的pH，可能倒下整整一瓶的鹽酸都不夠，硬生生把原本500ml加到了800ml也說不定。 

電泳原理 

聚丙烯酰胺凝膠電泳是網狀結構，具有分子篩效應，它具有兩種形式，一種是非變性聚丙烯酰胺凝膠，蛋白質在電泳中保持完整的狀態，蛋白在其中依三種因素分開：蛋白大小，形狀和電荷。  

  而SDS-PAGE僅根據蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白。這個技術首先是1967年由shapiro建立，他們發現在樣品介質和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，電荷因素可以忽視。  

  SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結構。而強還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使絆胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側鏈和SDS結合成蛋白- SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異。  

  SDS-PAGE一般采用的是不連續緩沖系統，于連續緩沖系統相比，能夠有較高的分辨率。  

  濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮**一個狹窄的區帶。當樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質帶負電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子**快，甘氨酸根離子**慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率**大，超過蛋白，因此在后面形成低電導區，而電場強度與低電導區成反比，因而產生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。  

  此鑒定方法中，蛋白質的遷移率主要取決于它的相對分子質量，而與所帶電荷和分子形狀無關。   

電泳中常見現象 

哈哈,我做過這個論文哈! 

1. 配膠緩沖液系統對電泳的影響？ 

      在SDS－PAGE不連續電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris－HCL緩沖系統，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris－甘氨酸緩沖系統。在濃縮膠中，其pH環境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導電性較低的區帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導電性與電場強度成反比，這一區帶便形成了較高的電壓剃度，壓著蛋白質分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區帶。當樣品進入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據其固有的帶電性和分子大小進行分離。 

      所以，pH對整個反應體系的影響是**關重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應首要考慮該因素。 2. 樣品如何處理？ 

      根據樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。 

      1）還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT（或Beta巰基乙醇）后，蛋白質構象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結合的分子，在電泳中，只根據分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。 

      2）帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經久牢固的保護SH基團，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現象。100ul樣品緩沖液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。 

      3）非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。 

3. SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？ 

      聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質電泳提供載體，其凝固的好壞直接關系到電泳成功與否，與促凝劑及環境密切相關； 

      制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇tris－HCL系統，TEMED與AP：AP提供自由基，TEMED是催化劑，催化自由基引起的聚合反應進行；十二烷基硫酸鈉（SDS）：陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質電荷、解離蛋白質之間的氫鍵、取消蛋白分子內的疏水作用、去多肽折疊。 4. 提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑？ 

      聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導致凝固不充分，后者可導致SDS結晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 

      一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的《蛋白質電泳技術手冊》P82-103。 5.“ 微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？ 

      主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現于較厚的凝膠中。       處理辦法：待其充分凝固再作后續實驗。 6. “皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？ 

      主要出現在蛋白質垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。 

      處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。 7. 為什么帶出現拖尾現象？ 

      主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。 

      處理辦法：加樣前離心；選擇適當的樣品緩沖液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。