30KD-10KD選用15%膠。4.2 要根據樣品濃度來加樣品溶解液。每加一個樣品后換一支吸頭或清洗吸頭后再點另一個樣品。4.3 制備聚丙烯酰胺凝膠時，倒膠后常漏出膠液，那是因為二塊玻璃板與塑料條之間沒封緊，留有空隙，所以這步要特別留心操作.4.4 電泳完畢撬板取凝膠時要小心細致不能把膠弄破。 4.5 電泳緩沖液可重復利用，如果膠上出現不正常痕跡，就要及時更換新液。4.6 分離膠高度控制得當，確保有大約1cm左右的濃縮膠空間。過長或過短均不能得到理想的電泳結果。4.7 電泳染色液注意進行回收再利用，一般可重復使用2-3次。4.8 AP和TEMED是催化劑，加入的量要合適，過少則凝膠聚合很慢甚**不聚合，過多則聚合過快，影響倒膠。
2、 配制分離膠(12%)（10ml）：
將分離膠上的水倒去，并用濾紙吸干多余水份，加入上述混合液，立即將梳子插入玻璃板間，完全聚合需15-30min。 4、待積層膠完全聚合后，小心拔出梳子，然后將玻璃板固定在電泳槽上。
5、樣品處理：將樣品加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100℃加熱3-5min， 12000g離心1min，取上清作SDS-PAGE分析，同時將SDS低分子量蛋白質Marker作平行處理。
6、上樣：取10μl誘導與未誘導的處理后的樣品加入樣品池中，并加入20μl低分子量蛋白Marker作對照。
7、電泳：在電泳槽中加入1?電泳緩沖液，連接電源，電泳時，積層膠電壓80V，分離膠電壓120V，電泳**溴酚藍行**電泳槽下端停止（約需2-3h）。
8、染色：將膠從玻璃板中取出，置于考馬斯亮藍染色液中染色，室溫4-6h。 9、脫色：將膠從染色液中取出，放入脫色液中，多次脫色**蛋白帶清晰。 #p#分頁標題#e#
10、凝膠攝像和保存：將脫色好的凝膠攝像，凝膠可保存于雙蒸水中或7%乙酸溶液中。 注意事項：
1、實驗組與對照組所加總蛋白含量要相等。
2、為達到較好的凝膠聚合效果，緩沖液的pH值要準確，10%AP在一周內使用。室溫較低時，TEMED的量可加倍。 3、未聚合的丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺具有神經毒性，可通過皮膚和呼吸道吸收，應注意防護。 試劑配制：
? 30%丙烯酰胺(29:1)配制：稱取Acrylamide 29 g、Bisacrylamide 1 g，加入約60 ml的去離子水，充分攪拌溶
解。加去離子水將溶液定容**100 mL，用0.45um濾膜濾去雜質，于中4℃避光保存。 ? 5×Tris-Glycine電泳緩沖液的配制：稱取Tris-base 15.1 g、Glycine 94 g、SDS 5 g置于1 L燒杯中，加入約800
mL的去離子水，攪拌溶解；加去離子水將溶液定容**1 L后，室溫保存。
? 10 %過硫酸胺(AP)的配制：稱取過硫酸胺0.1 g 溶于1.0 mL 滅菌的去離子水中，充分混勻后于4 ℃避光保
存，保存時間不能超過1周。
? 10 % SDS的配制：稱取SDS 10 g溶于100 mL滅菌的去離子水中并于50℃水浴下溶解，室溫保存。如在長
期保存中出現沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
? 1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)：稱取Tris-base 45.43 g，加入約200 mL去離子水，攪拌溶解；用濃鹽酸調pH**
8.8，**后用去離子水定容**250 mL，室溫下保存。
? 0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)：稱取Tris-base 15.14 g，加入約200 mL去離子水，攪拌溶解；用濃鹽酸調pH**
6.8，**后用去離子水定容**250 mL，室溫下保存。
? 12 % SDS-PAGE 分離膠：30%丙烯酰胺4 mL、去離子水3.3 mL、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)2.5 mL、10 % AP
100 μL、10 % SDS 100 μL和TEMED 5 μL充分混勻后灌膠。
? 15 % SDS-PAGE 分離膠：30%丙烯酰胺5 mL、去離子水2.3 mL、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)2.5 mL、10 % AP
100 μL、10 % SDS 100 μL和TEMED 5 μL充分混勻后灌膠。
? 5 % SDS-PAGE 濃膠：30%丙烯酰胺0.5 mL、去離子水2.1 mL、0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)0.375 mL、10 % AP
30 μL、10 % SDS 30 μL和TEMED 5 μL充分混勻后灌膠。
? 考馬斯亮藍染色液的配制：稱取1 g考馬斯亮藍R-250，置于1 L燒杯中；量取250 mL異丙醇加入上述燒杯
中，攪拌溶解；加入100 mL的冰醋酸，攪拌均勻；加入650 mL去離子水，攪拌均勻；用濾紙除去顆粒物質后，室溫保存備用。
? 脫色液的配制：量取冰醋酸 100 mL、乙醇50 mL，加去離子水定溶**1L，攪拌均勻，室溫保存備用。
? 轉移緩沖液的配制：稱取Tris-base 1.45 g、甘氨酸7.2 g，加入約200 mL去離子水，攪拌溶解；加入100 mL
甲醇，**后用去離子水定容**500 mL，室溫下保存備用。
? 洗膜緩沖液(TBST)的配制：稱取NaCl 8.8 g、Tris-base 2.42 g，向燒杯中加入約800 mL去離子水，充分攪拌
溶解；用1 M HCl將溶液的pH值調**7.5，加入0.5 mL Tween 20后充分混勻；加去離子水將溶液定容**1 L后，于4 ℃保存備用。
? 封閉緩沖液的配制：稱取0.5 g脫脂奶粉溶于10 mL TBST緩沖液中，充分混勻后備用。
0.1 M 甘氨酸緩沖液配制：稱取0.75 g甘氨酸加入90 mL去離子水，充分溶解后用pH計將pH值調**2.5，用去離子水定容**100mL后用0.22 µm 微孔慮膜過濾除菌后，將其分裝并于4 ℃保存備用。
? 1 M Tris-HCl 緩沖液的配制：稱取12.1g Tris-base，加入90 mL去離子水，充分溶解后用pH計將pH值調**
7.5，用去離子水定容**100mL備用。 ? 銀染固定液：30 % 的乙醇，10%的乙酸。
? 銀染氧化液：稱取0.7 g高碘酸溶于100 mL去離子水，充分混勻備用。 ? 銀染顯色液：濃度為0.005 g/L的檸檬酸，0.02 %的甲醛。
? 銀氨溶液：濃度為0.67 % 的硝酸銀，0.33 %的氨水，0.8 g/L的NaOH。
