A液：1mol/l Hcl 48.0 ml，Tris 36.4 克 ,TEMED 0.23 ml加水**100 ml pH 8.3。 B液：丙烯酰胺 28.0克 ；甲叉雙丙烯酰胺 0.735 克 加水**100 ml。 C液：過硫酸銨（用前配制）1.4 % 。 配膠：A：B：C：H2O = 1：2：0.4：4.6 配膠后立即灌好裝膠的玻璃管 3、點擊緩沖液配制
1、將各膠柱中酶帶條數、寬度、著色深淺和移動距離填入表中。
3、選擇比較組分膠柱中、著色**深的酶帶或特殊酶帶（即該組分特有的酶帶），計算酶帶的相對遷移率Rf值 Rf=（某酶帶遷移距離）/（溴酚藍指示劑遷移距離） 六、
結果討論及分析
1、配制緩沖液系統對電泳的影響：
在SDS-PAGE不連續電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris-HCL緩沖系統，濃縮膠是PH6.7，分離膠PH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris-甘氨酸緩沖系統。在濃縮膠中，其PH環境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導電性較低的區帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導電性與電場強度成反比，這一區帶便形成了較高的電壓梯度，壓著蛋白質分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區帶。當樣品進入分離膠后，由于膠中PH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場作用下，蛋白分子根據其固有的帶電性和分子大小進行分離。
所以，pH對整個反應體系的影響是**關重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應首要考慮該因素。 2、樣品的處理： #p#分頁標題#e#
根據樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：
還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。 1）還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT（或Beta巰基乙醇）后，蛋白質構象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結合的分子，在電泳中，只根據分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。
2）帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經久牢固的保護SH基團，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現象。100ul樣品緩沖液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。
3）非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。
3、SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用。
聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質電泳提供載體，其凝固的好壞直接關系到電泳成功與否，與促凝劑及環境密切相關；
制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇tris－HCL系統，TEMED與AP：AP提供自由基，TEMED是催化劑，催化自由基引起的聚合反應進行；十二烷基磺酸鈉（SDS）：陰離子去污劑，作用有四：去蛋白質電荷、解離蛋白質之間的氫鍵、取消蛋白分子內的疏水作用、去多肽折疊。 4、提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑.
聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導致凝固不充分，后者可導致SDS結晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的《蛋白質電泳技術手冊》P82-103。 5.“ 微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？
主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現于較厚的凝膠中。 處理辦法：待其充分凝固再作后續實驗。 6. “皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？ 主要出現在蛋白質垂直
電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。
處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。 7.帶出現拖尾現象可能原因。
主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。
處理辦法：加樣前離心；選擇適當的樣品緩沖液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。 8. 為什么帶出現紋理現象？ 主要是樣品不溶性顆粒引起的。
處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。 9. 什么是“鬼帶”，如何處理？
“鬼帶”就是在跑大分子構象復雜的蛋白質分子時，常會出現在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質分子重新折疊結合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻于目標條帶有相同的免疫學活性，在WB反應中可見其能與目標條帶對應的抗體作用。
處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。 10. 為什么溴酚藍不能起到指示作用？ 我們在實驗中常會遇到溴酚藍已跑出板底，但蛋白質卻還未跑下來的現象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關。
處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。 11. 為什么電泳的條帶很粗？
電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。
處理辦法：適當增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.7）；適當降低電壓；
12. 為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？這種現象一般初學者易出現。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。 處理辦法：電泳槽正確裝配即可。
13. 濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎？
這主要出現在初學者中，一般對電泳不會有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進入引起的。
14. 凝膠時間不對，或慢或快，怎么回事？
通常膠在30MIN-1H內凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS劑量不夠或者失效。APS應該現配現用，TEMED不穩定，易被氧化成黃色。 如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量過多，此時膠太硬易裂，電泳時易燒膠。 15. 電泳時間比正常要長？ #p#分頁標題#e#
可能由于凝膠緩沖系統和電級緩沖系統地PH選擇錯誤，即緩沖系統地PH和被分離物質的等電點差別太小，或緩沖系統的離子強度太高。 16.分離膠加上后為什么要立即加水？
加入分離膠后，立即覆一層雙蒸水，一是為了使分離膠界面保持水平，用水就可以把它壓平，使蛋白質分子跑時在同一水平線上；二是阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。
